Najstarszy dokument, dotyczący zakonu bernardyńskiego w związku z Grodnem pochodzi z 1494 r. Wtedy to Aleksander Jagiellończyk, Wielki Książę Litewski zapisał Bernardynom obszar dawnego grodu książęcego nad Niemnem, za miastem. Ale ani kościół ani klasztor wtedy prawdopodobnie nie powstały. Zakon Bernardynów przybył do Grodna najprawdopodobniej pod koniec XVI wieku. Sprawa budowy kościoła ożyła w 1586 r., kiedy to król Stefan Batory potwierdził nadanie wielkoksiążęce. Fundacja zaczęła nabierać realnych kształtów dopiero w 1595 r., gdy proboszcz kościoła farnego w Grodnie, Fabian Konopacki zwrócił się do prowincjała Bernardynów Benedykta Gąsiorka z prośbą o przyjęcie fundacji. Introdukcja (wprowadzenie na nowy teren) zakonników nastąpiła w tymże roku. Teren dawnych stajni królewskich ofiarowała im Anna Drucka Sokolińska. Tam właśnie Bernardyni mogli wystawić tymczasowy drewniany kościołek Świętego Krzyża. †

Świątynia Bernardynów w swej pierwszej wersji powstała w latach 1595-1600. Prawdopodobnie był to kościół ściennofilarowy, trójprzęsłowy. Rozbudowa świątyni trwała do roku 1618. Po zburzeniu jednonawowego korpusu pierwszego kościoła, wzniesiono trójnawową, czteroprzęsłową bazylikę. Od dawnego pierwszego kościoła zostało obecnie prezbiterium w stylu gotyckim. Konsekracji świątyni dokonał biskup wileński Eustachy Wołłowicz dnia 13 maja 1618 r., co upamiętnia tablica wmurowana w drugi północny filar świątyni.

Kościół miał rozsławiać swych fundatorów. Wysoka ściana ponad arkadami filarowymi od początku była przeznaczona pod dekorację i tam powstały freskowe malowidła przedstawiające herby dobrodziejów grodzieńskich Bernardynów.

W latach sześćdziesiątych XVII wieku istniało przy kościele bractwo Loretańskie. Potwierdza to „Indulgencja Papieża Aleksandra VII dla członków bractwa Domu Loretańskiego Matki Boskiej przy Grodzieńskim Bernardyńskim klasztorze”, wydana w 1666 r. Bractwo to musiało mieć w świątyni swoje miejsce, gdzie stał ołtarz z figurą Matki Boskiej Loretańskiej. Była to niewielka kaplica, dobudowana od strony północnej nawy, przy pierwszym przęśle. Zachowały się wiodące do niej drzwi.

Następny etap rozbudowy kościoła przypada na rok 1679. Wtedy to wojewoda wileński Michał Pac uzyskał zgodę na wybudowanie drewnianego pałacu na gruntach klasztornych. W zamian za to podjął się wystawienia prawdopodobnie Domku Loretańskiego przed frontem kościoła. Budowa Loreto trwała w 1679-1682 latach. Śmierć fundatora przerwała budowę. Jednak brat Michała Paca – biskup wileński Kazimierz Pac przekazał Bernardynom cegielnię i grunty. W 1682 r. ruszyła kolejna przebudowa kościoła. Budowniczowie nie kontynuowali wznoszenia Loreto, prace były zakrojone o wiele szerzej. Na linii zachodniego muru wieży wytyczona została nowa fasada. W ten sposób kościół został powiększony o kolejne, piąte przęsło. Już w 1683 r. do piątego przęsła kościoła przesunięto chór muzyczny, a po obu jego stronach powstały dwie szczytowe kaplice. Budowa nowej fasady trwała do 1686 r. i być może wtedy została podwyższona wieża. Nowa fasada została ozdobiona rzeźbami stojącymi w niszach – św. Heleny, św. Antoniego i św. Bernardyna.

W roku 1683 była wystawiona kaplica św. Barbary, a w 1686 r. Papież Innocenty XI powołał Bractwo św. Barbary. Jest to kaplica znajdująca się w ostatnim przęśle kościoła, po stronie północnej (czyli obecna loretańska). Druga kaplica, leżąca naprzeciw, nosiła wezwanie św. Kazimierza.

Wielki ołtarz został w 1680 r. zbudowany na nowo, a obraz Matki Boskiej zamieniono na istniejący tam do dzisiaj krucyfiks, co bardziej odpowiada wezwaniu kościoła. Wśród ołtarzy bocznych, jeden, wystawiony przez Marynę Dłuską poświęcony był św. Antoniemu, inny, z fundacji Wilkawskiego nosił wezwanie Matki Boskiej Częstochowskiej. W latach 1680-1683 wykonane zostały stalle ozdobione rzeźbionymi scenami z życia św. Antoniego. W 1687 r. gwardian Hladowicki dał ozłocić ołtarz wielki i stalle. A w 1694 r. przyjechały do kościoła obrazy namalowane w Wilnie i ołtarze św. Franciszka i Anny.

W latach trzydziestych była dokonana restauracja wieży, w 1760 r. powstał ołtarz Niepokalanego Poczęcia NMP ufundowany przez Adama Lenkiewicza. W wieku XVIII w kościele wiele śię zmieniło w wystroju wnętrza. Wtedy właśnie powstały najcenniejsze elementy wyposażenia, z których jedynie część dotrwała do czasów obecnych. Jeszcze przed połową XVIII wieku musiały powstać organy.

W 1753 r. w Grodnie wybuchły dwa groźne pożary. Straty były ogromne. Po tym pożarze Bernardyni musieli odbudować zniszczoną część klasztoru i wieżę, której konstrukcja była naruszona przez ogień. Wtedy właśnie powstały dwie górne kondygnacje dzwonnicy. Po odnowieniu wieży postarano się o nowe dzwony.

Kolejny pożar, który wybuchł w 1782 r. strawił część śródmieścia i fary. Być może na skutek zniszczeń  zostały rozpoczęte remonty wewnątrz świątyni. W roku 1788 w kościele pojawił się zespół dwunastu nowych, klasycystycznych ołtarzy z funduszu Czereńkiewicza. W górnej kondygnacji ołtarzy znajdują się stacje drogi krzyżowej, a dwie wiszą osobno na ścianach kościoła. Wtedy też musiało nastąpić „sklasycyzowanie” całego wnętrza. Również po 1788 r. kaplicę św. Barbary zamieniono na Loretańską. Cały kościół otrzymał nowe freski.

Od 14 grudnia 1795 r. Miasto Grodno znalazło się w zaborze rosyjskim. 14 kwietnia 1853 r. nastąpiła kasata konwentu Bernardynów w Grodnie. Wtenczas w klasztorze mieszkało 8 zakonników. Od 1858 r. klasztor był w posiadaniu miasta. Miały tam siedzibę wojska carskie. Po zamknięciu klasztoru zakonnicy udali się między innymi do Iwja. Kościół uzyskał status świątyni parafialnej. Na początku XX stulecia kościół został gruntownie odnowiony. Organy na 30 głosów zostały zbudowane w roku 1911 z zachowaniem pięknej struktury drewnianej z XVIII wieku.

W czasie II wojny światowej zabudowania zespołu pobernardyńskiego częściowo spłonęły. 22 czerwca 1941 r. bomba z niemieckiego samolotu spadła na sklepy żydowskie z naftą obok kościoła. Wybito okna, spalił się dach kościoła, klasztoru i wieży. Pod gruzami zniknęły wspaniałe XVIII-wieczne organy i trzy stare ołtarze z kaplicy św. Kazimierza. Prace przy odbudowie rozpoczęto szybko i już w 1946 r. świątynia odzyskała swój pierwotny kształt. W kaplicy św. Kazimierza stanął ołtarz Serca Jezusowego.

Kościół pobernardyński nigdy nie był zamknięty dla wiernych. Od 1 września 1990 r. klasztor mieści Wyższe Seminarium Duchowne. W 1995 r. rozpoczął się obszerny remont świątyni, zorganizowany przez proboszcza, ks. prałata Antoniego Chańko. W ubiegłym roku została odnowiona i pomalowana wieża. W planach jest przewidziany dalszy remont.

Po zburzeniu Fary Witoldowej przez władze radzieckie, kościół Pobernardyński jest obecnie najstarszą świątynią katolicką w Grodnie.